Tramite analisi visiva al microscopio: identificazione su base morfologica

È la tecnica che applichiamo per la validazione dei lotti in produzione, essendo la più rapida, ed è sufficientemente efficace quando eseguita da personale esperto; solo in alcuni casi sono richieste analisi supplementari nel caso di micorrize molto simili a quella del fungo desiderato. Si procede normalmente ad un campionamento casuale nei lotti omogenei per specie di pianta, fungo e modalità di inoculazione ed allevamento, campionando almeno l’uno per cento delle piante. I criteri di valutazione sono svariati e non è ancora stato raggiunto un accordo unificatorio, tuttavia tutti tengono conto della necessità di avere una certa percentuale di micorrize della specie richiesta su tutte o quasi tutte (almeno il 30 % per alcune specie con punte del 90% per altre) le piante esaminate, con presenza scarsa o nulla di altri funghi potenzialmente competitori. Le piante prescelte vengono lavate sotto acqua corrente e l’apparato radicale esaminato dapprima sotto stereomicroscopio, quindi alcuni apici per sicurezza possono essere prelevati e osservati in trasparenza al microscopio.

Questa tecnica viene utilizzata anche per il riconoscimento delle micorrize nelle nostre tartufaie coltivate  per verificare l’andamento della tartufaia, ma anche verificare l’assenza di specie competitrici che potrebbero influenzare la produzione.

Tramite analisi biomolecolari

Le micorrize di T. brumale e di T. indicum sono morfologicamente molto simili a quelle di T. melanosporum. Così anche le micorrize di T. magnatum e quelle di T. borchii.  In fase di verifica delle micorrizazione radicale, è stata recentemente messa a punto una tecnica di controllo che permette di determinare univocamente la specie di tartufo che partecipa alla simbiosi micorrizica, mediante l’analisi biomolecolare del DNA fungino. Questa tecnica viene applicata quando l’analisi morfologica differenziale delle forme micorriziche non è sufficiente ai fini di una validazione. Tenuto conto che si tratta di una analisi molto onerosa, viene applicata solo nei casi di contestazione o per specifici controlli di certificazione, soprattutto nel caso di micorrizazione con T. magnatum, e Boletus edulis. La tecnica fu messa a punto agli inizi del 2000, nell’ambito di un progetto di studio finanziato dal CNR e da dieci regioni italiane fra cui il Piemonte. Il progetto aveva come obiettivo la certificazione delle micorrize del genere Tuber mediante le analisi del DNA.  Il DNA è una lunga molecola formata da due filamenti paralleli che si susseguono in una sequenza che è unica e caratteristica per ogni individuo. La sequenza di questi filamenti determina i caratteri dell’individuo, vale a dire il suo codice genetico. Ogni organismo, possiede del DNA che comprende alcune regioni con sequenza costante  ed altre con sequenza variabile, anche da specie a specie. Con specifiche procedure si effettua l’estrazione del DNA da corpi fruttiferi o dalle micorrize dei funghi da analizzare. Successivamente si applica la PCR (polymerase chain reaction) che permette l’amplificazione delle regioni ITS. Tale passaggio costituisce la parte più delicata ed importante dell’analisi; infatti, permette la corretta identificazione biomolecolare dei campioni. Questa tecnica seppur m0lto precisa è comunque molto costosa e con tempi più lunghi rispetto all’analisi allo stereo microscopio.

NB: Le analisi morfologiche e biomolecolari degli apici radicali vengono generalmente eseguite a partire da sei mesi dall’inoculazione.